隨著經濟快速發展，全球對能源需求劇增。傳統化石能源日益枯竭難以支撐經濟可持續發展，并且化石能源使用產生的溫室氣體對環境產生了巨大危害，所以迫切需要發展替代石化能源的可再生能源。與石化燃料相比，生物燃料源于可冉生的生物質資源，其燃燒產生的CO2可經植物光合作用重新轉化為生物質，實現綠色、可持續循環‘引。發展生物燃料對經濟社會發展以及同家安全具有重要意義。得到了國內外學術界和政府部門的重視，取得了很多令人振奮的成果。
    燃料乙醇和生物柴油是當前生物燃料研究的熱點，其生產成本在持續下降。但是燃料乙醇作為汽油替代品，其水溶性、揮發性、熱值低等缺點制約著其大規模使用。先進生物燃料(Advanced biofuel)是指以高產非糧作物、農林廢棄物、其他可持續性生物質或者藻類為原料，通過化學、物理、生物甚至必要的組合技術，轉化獲得的具有與化石燃料相當甚至更高能量密度，易于儲存和運輸的燃料分子。由于其性能優良和可持續性，先進生物燃料近來受到學術界和工業界重視。基于微生物代謝的生物技術對設汁和制造先進生物燃料分子具有重要意義。美同加州大學洛杉磯分校學者通過合成生物學手段改造大腸桿菌Escherichia coli氨基酸生物合成途徑，合成了一系列碳鏈稍長的醇類化合物，并且大幅度提高了產量，為生物汽油發展提供了新思路。生物柴油和石油來源的柴油性質相似，如果能進一步降低綜合生產成本，將具有巨大市場潛力。然而，生物柴油當前面臨最重要的瓶頸問題是植物油脂資源非常有限，難以支撐產業發展。另外，中長鏈(碳鏈長度C10一C18)燃料如航窄煤油目前尚沒有非常有效的途徑獲取生物基替代品。最近關于微生物脂肪酸生物合成途徑的認識和改造取得了一些成果，拓展了生物燃料的合成路線。
以下綜述了近年來理性改造脂肪酸途徑獲取以脂肪酸代謝衍生物為日標的生物燃料研究，并展望了合成生物學策略在設計、改造隹物燃料代謝途徑中的應用。
1  合成生物學概念的內涵及其蓬勃發展
    合成生物學一詞早在1911年就出現在法國物理化學家Stephane Leduc所著“生命的機理(The Mechnism of Life)”一書中。1980年，Hobom B將其定義為利用重組DNA技術對細菌進行基因工程改造。隨著分子系統生物學的發展，2000年Kool等在美國化學年會上重新提出，定義為基于系統生物學的遺傳工程，從人工堿基DNA分子、基因片段、基因調控網絡與信號傳導路徑到細胞的人1二設計與合成。西方學者對合成生物學比較一致的定義是：利用工程理念理性合成復雜、具有生物意義的不同層次系統一從單個生物分子到整個細胞、組織、器官，而這些合成的生物系統能執行自然界所沒有的功能。合成生物學、計算生物學與化學生物學一同構成系統生物技術的方法基礎。
    近幾年合成生物學發展十分迅速，世界上多國政府部門及眾多學者開始關注合成生物學研究，合成生物學也因此取得了蓬勃發展，并在天然產物、生物能源等領域取得了令人矚目的成績。比如：美國學者先后在E．coli和釀酒酵母Saccharomvces cerevisiae中構建了青蒿素前體生物合成途徑，并進行代謝工程優化，在S．cerevisiae中獲得149 mg／L的青蒿酸，有望降低青蒿素生產成本，為非洲貧窮瘧疾患者帶來了希望。為了獲得性能更好的汽油替代品，在E．coli中引入2一酮酸脫羧酶(KDC)和乙醇脫氫酶(ADH)對氨基酸生物合成途徑進行改造，構建了異源的醇類生物合成途徑，合成了一系列碳鏈長度(c3一C8)醇類生物燃料，其中異丁醇產量最高達到22 g／L。為了增加抗癌藥物紫杉醇產量，降低其生產成本，在E．coli中構建紫杉醇前體生物合成途徑，通過模塊優化策略優化生物合成途徑，其紫杉二烯產量達到1．0 g／L，5一羥基紫杉二烯產量達到60 mg／L。最引人注目的成果當屬2010年Venter研究所成功地將人T合成的蕈狀支原體Mycoplasma mycoides基因組轉入到山羊支原體Mycoplasma capricolum宿主細胞中，獲得了具有生存和自我復制能力的新菌株。
    合成生物學的蓬勃發展使人們對微生物理性改造有了更深入的認識，也給現代工業生物技術提供了更有效的工具。近年來，生物燃料研究也充分利用了合成生物學最新發展理念，加速了其自身發展。除了上述利用合成生物學成功生產汽油替代品(c3一C8醇類)外，人們開始利用合成生物學策略改造脂肪酸途徑合成能量密度更高，性能更好的中長鏈生物燃料。
2  合成生物學改造脂肪酸途徑合成生物燃料
模式微生物E．coli、S．cerevisiae等由于其遺傳背景清楚，遺傳操作手段成熟，被廣泛用作合成生物學研究宿主。而脂肪生物合成能力較強的產油微生物遺傳背景認識非常有限，尚難以進行合成生物學改造。目前脂肪族生物燃料的研究主要集中在E．coli中。
2．1 E coli脂肪酸代謝途徑
    E．coli脂肪酸合成途徑及其調控機制已得到廣泛研究。乙酰-CoA經羧化得到丙二單酰一CoA后，經脂肪酸合成酶合成脂酰-ACP，隨后經硫酯酶催化合成脂肪酸。在E．coli中，大部分脂酰-ACP經過甘油一3一磷酸酰基轉移酶轉移到甘油衍生物合成磷脂，少量的合成類脂等物質。當脂肪酸在E．coli中過量積累時，被快速轉化為脂酰-CoA，然后經過β氧化途徑分解成乙酰一CoA。E．coli脂肪酸牛物合成途徑受一系列機制嚴格調控，脂肪酸調節子的轉錄嚴格受到FadR和FabR調控，乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合成途徑的FabH(3-酮酰-ACP合成酶III)和FabI(烯酰ACP還原酶)受到長鏈脂酰-ACP反饋抑制。這些機制一起限制細胞內脂肪酸及其衍生物過量積累。所以，要大量合成脂肪類生物燃料，必須打破其調節機制，促進脂肪酸大量合成。最常用的策略之一是敲除脂肪酸分解途徑關鍵基因fadD和fadE以減少脂肪酸分解；另外，過表達植物來源以及內源的硫酯酶解除長鏈脂酰一CoA反饋抑制，也可以加強脂肪酸合成。
2．2脂肪酸途徑改造合成生物柴油
    生物柴油是指短鏈一元烷醇脂肪酸酯，目前生物柴油通常是通過甘油三酯與短鏈醇類進行酯交換反應得到。隨著生物柴油需求增加，這個策略暴露了越來越多的缺點。首先其依賴于植物油脂供應，我國植物油脂資源極其短缺，現有油料作物年產油脂在1 000萬t左右，尚不足以滿足國內食用油消費市場需求。近幾年油脂進口量逐年遞增，2009年超過900萬t，是全球最大植物油凈進口國。其次生物柴油轉酯化需要消耗大量勞動力和能量，勢必會減少其轉化率，增加成本。所以迫切需要尋找新技術以支撐生物柴油產業發展。為了解決這個問題，策略之一是尋找新的油脂來源。微生物油脂因其生產強度高，占用耕地面積少而受到廣泛關注；另一種策略是利用微生物直接生產生物柴油，這種策略避免了轉酯化等過程，也引起了重視。在E．coli進行中過表達來源于運動單胞菌Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶增加乙醇供應，并表達來源于貝氏不動桿菌Acinetobacter baylyi的酰基轉移酶。在培養基中添加油酸進行有氧發酵，脂肪酸乙酯(FAEE)產量達到1．28 g／L，FAEE含量達到細胞生物量的26％。由于這個過程要在胞外添加油酸，使其更像一個生物轉化過程，但FAEE高產量對未來脂肪酸途徑改造研究具有重要參考價值。
為了實現生物柴油體內生物合成，敲除E．coli DHl脂肪酸分解基因fadD增加脂肪酸供應，表達硫酯酶TesA、脂酰．CoA連接酶ACL、酯合成酶AtfA，從而構建了脂肪酸乙酯(FAEE)生物合成途徑。然后過表達來源于z mobilis的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶加強乙醇生物合成途徑，FAEE產量最大達到674 mg／L，為理論產量的7．4％。相信對生物合成途徑進行優化改造能進一步提高FAEE產量。
2．3脂肪酸途徑改造合成脂肪酸和脂肪醇
    脂肪酸是微生物合成生物柴油的前體，也可以用作油脂化工行業的基本原料。如果能利用微生物過量生產脂肪酸，對生物燃料和生物基化學品生產具有重要價值。因此，已有研究對脂肪酸生物合成途徑進行改造并增加脂肪酸產量。如通過敲除E．coli的fadD基因限制長鏈脂肪酸分解途徑；過表達來源于油料植物種子的硫酯酶以加強脂肪酸合成速率；過表達乙酰-CoA羧化酶增加前體丙二酸單酰一CoA的供應；表達內源硫酯酶解除長鏈脂酰一CoA反饋抑制，最后脂肪酸產量達到2．5 g／(L·d)，生產強度為0．024 g／(h·g DCW)。在此基礎上，將油料植物種子的硫酯酶和E．coli內源的硫酯酶在阿拉伯糖誘導啟動子下串聯表達，脂肪酸產量達到4．0 g／(L·d)，生產強度達到0．04 g／(h·g DCW)。這已經很接近現在乙醇工業的生產強度O．1 g／(h．g DCW)。有類似報道在敲除脂肪酸分解途徑的菌株中過表達來源于植物的脂酰一ACP硫酯酶和乙酰．CoA羧化酶獲得了約0．8 g／L脂肪酸。在高產脂肪酸菌株的基礎上，通過表達脂酰．CoA連接酶和脂酰．CoA還原酶，構建了脂肪醇生物合成途徑，脂肪醇產量達到60 mg／L。除E．coli外，也有報道對藍細菌脂肪酸合成進行改造，在藍細菌Synechocystis sp．PCC6803中過表達來源于好好芭Simmondsia chinensis的脂酰一ACP還原酶，利用C02作為碳源，脂肪醇產量達到0．2 rag／(L~0D730)。但是藍細菌脂肪酸途經調節機理不夠清楚，如何進一步進行代謝工程改造制約著產量進一步提高。
2．4脂肪酸途徑改造合成脂肪烴
    烷烴和烯烴是汽油、柴油、航空煤油的最主要成分。在自然界中，許多生物能夠體內能夠合成烴類化合物，藍細菌就是其中一種。然而，其生物合成的一些關鍵代謝步驟還沒有得到清晰認識，因此也就很難通過合成生物學構建烴類生物合成途徑。美國LS9公司通過差減策略從藍細菌Synechococcus elongatus PCC7942中鑒定到烷烴生物合成基因脂酰．ACP還原酶編碼基因和醛脫羰基酶基因，并對其表達酶生物化學性質進行了研究，其催化生物反應。在E．coli中共表達脂酰-ACP還原酶和醛脫羰基酶，得到超過300 mg／L的烷烴，并且80％以上的烷烴是在細胞外。除了烷烴外，還生成了一定的醇類，這可能是由大腸桿菌內源的還原酶將中間產物脂肪醛還原產生的。但是，在體外實驗中脂酰一ACP還原酶和醛脫羰基酶共同催化脂酰．ACP并沒有醇生成。如果增加醛脫羰基酶活力，并且通過代謝工程改造降低細胞內源的脂肪醛還原酶活力有可能將細胞內積累的醇類進一步轉化為中長鏈烴，提高脂肪烴生產能力。
3脂肪族生物燃料生物制造的展望
    利用合成生物學理論與技術已實現了生物柴油、生物汽油、中長鏈烷烴等的微生物合成，但其產量還不夠高，尚不能達到工業化生產水平。進一步通過合成生物學及代謝丁程手段構建高產菌株是未來發展方向。將來可以從3個方面入手：1)挖掘與改造合成生物學元件。自然界中資源豐富，有很多高效基因及酶有待于挖掘，設計高通量的篩選策略挖掘高效的基因元件為下一步合成生物學改造提供材料。近幾年興起的宏基因組技術和比較基因組學是篩選生物元件良好策略，如利用宏基因組技術從白蟻中發現了多個纖維素酶，最近又有報道利用宏基因組技術從牛胃中發現一系列纖維素酶，為纖維素高效利用菌株構建提供了材料。另外，自然界中挖掘的元件異源表達時有時候活性不高，選擇性不夠，需要進一步通過蛋白質工程和酶工程改造或者根據其功能設計新型元件使其更高效。2)組裝生物燃料相關元件并協調其功能。DNA組裝技術為代謝途徑快速組裝提供了很好的方案。通過在E．coli中表達含有多種結構域的蛋白支架(Protein scaffold)，加州大學學者成功地將代謝途徑相關的酶錨定在蛋白支架上，代謝流得到協調，目標產物生產能力提高77倍。但是，蛋白質支架技術在其他宿主特別是真核生物以及其在不同途徑中的有效性，目前尚不清楚，所以必須發展新技術調控代謝流。3)提高宿主對燃料分子的耐受性。生物燃料分子的毒性直接影響細胞生長及代謝，從而限制產量進一步提高，所以增加宿主產物耐受性對獲得高產很有必要。傳統馴化篩選策略雖然能獲得耐受性好的菌株，但比較耗時耗力，且菌株遺傳性狀不夠穩定，易于產生回復突變。近幾年發展的全局轉錄工程通過改造轉錄因子，獲得了穩定的乙醇高耐受性菌株，值得借鑒。另外，有學者通過人工轉錄因子技術，使E．coli對丁醇的耐受性提高到1．5％。如果能夠在這三方面整體突破，將會獲得高產量脂肪類生物燃料生產菌株。
    目前，合成生物學宿主一般采用遺傳操作平臺成熟的模式生物。然而，它們的脂肪酸代謝能力還遠低于產油微生物。另外，模式生物工程菌株可能存在如產物耐受性低、原料適應范圍窄、抗逆性弱等性狀缺陷。而產油微生物脂肪酸生物合成能力強，并且還存在高效異戊二烯途徑，如果實現類胡蘿卜素、甾醇等聯產就有可能顯著降低生物燃料成本。因此，選擇合適的宿主，構建其遺傳操作平臺，充分利用微生物代謝產物聯產策略，可能是進一步提高微生物生物燃料生產競爭力的重要途徑。
    總之，脂肪族生物燃料由于其熱值高、不易揮發等良好性能受到廣泛關注。但目前還面臨菌株生產能力低、耐受性和原料適應性差等問題。合成生物學理念和技術將促進脂肪族生物燃料生物制造快速發展，為生物能源產業提供技術支撐。